Протокол работы семинара "Хирургия, онкология, иммунология, гематология" от 10.02.98.

Председатель: Виктор Алексеевич Тарасов д.м.н., профессор, заведующий кафедрой торакальной хирургии Медицинской академии последипломного образования, главный хирург городской больницы № 26 (Санкт-Петербург).

Секретарь: Бояркин Г.М (Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад. И.П.Павлова, субординатор).

Доклад:

Опухолевый супрессор - р53.

к.б.н. Т.В. Кислякова

Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург).

С момента открытия считалось, что р-53 является онкогеном в связи с тем, что содержание его в сыворотке крови увеличивалось при наличии опухолевого процесса в организме. Также этот белок обнаружен в различных опухолевых линиях. Было высказано предположение, что р-53 связан с большим Т-антигеном вируса SV-40. Однако, дальнейшие исследования показали, что гены кодирующие синтез р-53 различны в опухолевых и неизменённых клетках. По данным некоторых авторов точечная мутация в гене встречалась в 50% исследованных человеческих опухолей. Показано, что нормальный р-53 подавляет пролиферацию клеток в культуре в том числе и опухолевых. Мыши, не имеющие в своём геноме гена синтеза р-53, в раннем возрасте погибают от множественных опухолей. Таким образом, к началу 50-х сложилось представление о р-53 как о супрессоре опухолевого роста.

В делящейся клетке р-53 осуществляет контроль клеточного цикла, сопрягая процесс регуляции размножения с регуляцией стабильности клеточного генома.

В нормальной клетке содержание р-53 низкое, что, по-видимому, связано с его разрушением. Однако, ряд стимулов приводит к стабилизации, увеличению содержания и активации молекулы р-53 в клетке. Этот продукт связывается с ДНК, запускает каскад генов кодирующих синтез р-21 - прямого ингибитора клеточного цикла в фазе G1, с помощью других посредников также возможна остановка цикла в фазах G2 и М. Если происходит репарация повреждения, клеточный цикл продолжается. Другая функция р-53 - индукция апоптоза в ответ на повреждение с помощью активации транскрипции генов каскада, приводящего к запрограммированной гибели. Основными стимулами к синтезу р-53 являются:

Особенность р-53 в опухолевой клетке - мутация в гене р-53 по данным некоторых авторов встречающаяся в 50% исследованных опухолей. Определение места мутации показало, что наиболее часто встречались изменения в ДНК связывающем домене, приводящие к нарушению конформации, потере активности р-53. Кроме того, для нормальной функции необходим транспорт р-53 в ядро из цитоплазмы, который не осуществляется в некоторых опухолевых линиях. Существуют другие возможности инактивации р-53 - взаимодействие с деградирующими ферментами. Амплификация гена mdm 2 осуществляющего в интактных клетках функцию отрицательной обратной связи с активацией р-53. Показано, что нормальная функция р-53 несовместима с опухолевым ростом, а трансфекция гена синтеза останавливала рост всех исследованных опухолевых культур.

Обнаружено, что все ДНК-содержащие вирусы имеют белки, которые блокируют апоптоз ниже р-53, и непосредственно связывающиеся с р-53: SV-40 -Т-антиген, папилломавирус - p-6, аденовирус - E-1b.

Мутация в гене р-53 снижает возможность запуска апоптоза в клетках с помощью рентгено- и химиотерапии. При исследовании грудных карцином обнаружено, что в данных новообразованиях чаще нет мутации р-53, что говорит о возможности применения этих методов лечения.

Исследованы способы реактивации функции р-53. Для нормальной активности необходимо аллостерическое взаимодействие ДНК-связывающего домена с С-концом. Показано, что введение олигопептида, подобного С-концу, восстанавливает функцию р-53. Для транспорта в клетку пептид сливают с белком, который свободно проникает через клеточную мембрану. Однако, вопросы о возможности использования данной конструкции в организме и взаимодействии пептида с нормальным белком остаются открытыми.

Обнаружено, что аденовирус содержит Е 1а иммортализующий онкоген. Однако, в ответ на активацию онкогена происходит увеличение синтеза р-53, приводящего к гибели клетки. Существует другой белок аденовируса - Е 1b, синтез которого запускается позже. Данный белок взаимодействует с р-53 и блокирует апоптоз, происходит репликация вируса и лизис клетки. Выделен мутант вируса (ONYX 015), который не содержит Е 1b, что делает возможным его размножение только в клетках, не имеющих р-53 в активном состоянии. Таким образом, это свойство делает вирус избирательно токсичным для опухолевых клеток, в которых вирус беспрепятственно реплицируется и приводит к литической инфекции. При этом в нормальных клетках репликация блокируется нормально функционирующим р-53.

Проведен опыт на культурах опухолевых клеток человека, на безтимусных мышах с внутривенным, внутриопухолевым, внутриперитонеальным введением данного вируса. При этом опухоли были мутантами по гену р-53, что определяло их устойчивость к химиотерапии. Вирус вызывал избирательный лизис опухолевых клеток. Показана эффективность сочетанного введения цисплатина и вируса для лечения этих опухолей. Однако до сих пор не исследовано действие вируса в нормальных клетках. Также применение ограничивается возникающим В-клеточным иммунитетом, и потенцируется Т-клеточным ответом. В данный момент (ONYX 015) проходит первую фазу клинических испытаний.

Обсуждение:

С.Б.Оникиенко к.м.н. (Военно-Медицинская Академия, кафедра военно-полевой терапии, зам. начальника кафедры (Санкт-Петербург)):

- Какова роль иммуноглобулинов в нарушении нормальной функции р-53?

Т.В.Кислякова:

- Существуют иммуноглобулины к мутанту, дикому типу р-53, которые также используются как маркеры опухолевого процесса, но его функции не блокируют.

Ф.С.Носков д.м.н., профессор (Институт им. Пастера (Санкт-Петербург)):

- В 50% случаев в опухоли ген р-53 остаётся неизменным. За счёт чего угнетается функция р-53?

Т.В.Кислякова:

- Функцию р-53 могут угнетать другие механизмы. В некоторых опухолях р-53 локализуется в цитоплазме и отсутствует в ядре, что препятствует его нормальной функции, возможно, р-53 остаётся связанным с рибосомами. Существуют другие механизмы инактивации р-53.

Ф.С. Носков:

- Первично или вторично возникновение мутации в гене р-53?

Т.В.Кислякова:

- Для возникновения опухоли обязательна мутация или инактивация р-53, но необязательна первичность этих изменений.

В.А. Тарасов:

- Связан ли плохой рост культуры опухоли с р-53?

Т.В.Кислякова:

- В культуре апоптоз может быть как зависимым, так и независимым от р-53, в связи с тем, что существуют другие системы апоптоза не связанные с р-53.

В.А. Тарасов:

- Известно, что рак желудка резистентен к химиотерапии. Каково состояние р-53 в этом случае?

Т.В.Кислякова:

- Возможно, в этом случае также вовлечена система р-53, однако, на данный момент отсутствуют сообщения о подобных исследованиях.

Ф.С. Носков:

- Существует ли связь между функцией интактного р-53 и содержанием мутантного белка?

Т.В.Кислякова:

- Мутант осуществляет доминантно негативное действие, так как р-53 функционирует как олигомер, а попадание в клетку мутантного белка угнетает нормальную функцию олигомера р-53.

Ф.С. Носков:

- Какие существуют механизмы регуляции уровня р-53?

Т.В.Кислякова:

- Описанная мной система гена mdm 2, система деградирующих, фосфорилирующих (специфические киназы) ферментов. Однако, данный вопрос недостаточно изучен.

М.С. Раутиан к.б.н. (Санкт-Петербургский государственный университет):

- Почему в опухолевых клетках всегда много р-53?

Т.В.Кислякова:

- Вероятно, изменённый р-53 не активирует систему mdm 2.

М.С. Раутиан:

- Существуют ли другие формы регуляции клеточного цикла. Почему их нарушение не проявляется при опухолях? Почему они не функционируют в случае нарушения системы р-53? Почему обязательно угнетение функции р-53?

Т.В.Кислякова:

- Трудно назвать не зависящие от р-53 пути регуляции клеточного цикла, а опухоли, не имеющие мутацию в гене р-53, очень быстро её приобретают, что приводит к дестабилизации генома и к увеличению способности опухоли к выживанию в результате неконтролируемого роста и повышенной изменчивости.

М.В. Филатов к.б.н (Петербургский институт ядерной физики, лаборатория биологии клетки):

Т.В.Кислякова:

- Дефицит р-53 встречается не только в опухолях, и, по-видимому, первичность этого дефицита не обязательна, но обязателен его дефект впоследствии.

В.А. Тарасов:

- Что необходимо для активации апоптоза добавить дикий р-53 или убрать мутант?

Т.В.Кислякова:

- Увеличение в культуре синтеза р-53 приводит к апоптозу. Основные же исследования связаны с С-концевыми пептидами аналогами С-конца р-53 приводящими в итоге к его активации.

В.А. Тарасов:

- Какие трудности встречает введение пептида в клетку?

Т.В.Кислякова:

- В культуре транспорт пептида осуществляется с помощью fusion protein свободно проникающего через клеточную мембрану. Применение данной конструкции ограничивается, по-видимому, возможностью гиперактивации р-53 в нормальной клетке.

М.С. Раутиан:

- Что происходит в нормальных клетках после внедрения ONYX 015?

Т.В.Кислякова:

- В модели репликации вируса в нормальных клетках не обнаружено, однако, данный вопрос недостаточно изучен.

М.В. Филатов:

- Какие повреждения запускают синтез р-53? Одинаково ли эффективны ультрафиолетовое облучение и радиация?

Т.В.Кислякова:

- Основными факторами являются тепловой шок, разрыв ДНК, гипоксия, истощение пула нуклеотидов, отсутствие факторов выживания. Радиация и ультрафиолетовое облучение при этом одинаково эффективны.

[an error occurred while processing this directive]